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杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy,简称“DMD”)是一种X连锁隐性遗传的肌营养不良症,在活产男婴中的患病率约为1/6000-1/4000,是一种罕见病,女性病例较为罕见。该病的致病基因位于染色体Xp21的抗肌萎缩蛋白基因,有79个外显子,是人类最大的基因之一。

MLPA可快速且准确地检出基因的大片段缺失或重复变异,故成为DMD患儿的首选检测手段,但该技术无法检出非缺失与重复的突变。外显子靶向捕获二代测序和全外显子测序是DMD患儿常用的诊断手段。但二代测序属于短读测序,在识别结构突变时存在固有的局限性。此外,目前临床上常用的方法还有核型分析、荧光原位杂交法等。

该《报告》通过回顾性分析,对2020年6月在上海新华医院儿内分泌遗传科就诊的1例DMD病例进行研究。该患儿2020年6月12日(7月龄)因肺炎住院治疗。当时患儿能翻身、能独坐,无明显大运动发育落后,查体未发现腓肠肌肥大,针对DMD基因的MLPA检测未发现缺失/重复。10月龄时,进一步进行全外显子组测序检测,未检出相关基因变异。21月龄时,家长发现患儿走路不稳,容易摔跤。自发病以来,患儿智力、语言发育正常。

澎湃新闻此前曾报道,DMD又被称为“罕见病中的常见病”。患者一般在3至5岁出现症状,肌肉萎缩,若不及时干预治疗,通常在12岁前失去行走能力,并在20至30岁左右死于心肺衰竭。国内尚无特效药上市。

有研究对来自孤独症谱系障碍或智力障碍、先天性畸形、生殖障碍、染色体病和产检异常的85个样本进行验证,涉及缺失、重复、异位、倒位、环状染色体和复杂重排等多种类型的结构突变,结果发现OGM对于结构突变的检测结果与传统方法达到100%的一致性。

OGM除了能发现DMD患者的致病变异外,还能识别母亲携带的结构突变,在DMD诊断及携带者筛查中具有重要的临床意义。DMD基因区域结构的复杂性决定了变异的多样性,因此,DMD的基因诊断需结合多种检测方法。而OGM能够成功识别DMD基因的倒位突变,有望成为DMD患儿的重要补充诊断手段。

近日,上海交通大学医学院附属新华医院小儿内分泌遗传代谢科主任医师、教授张惠文在《临床儿科杂志》上发表的研究文章《利用光学基因组图谱技术诊断杜氏肌营养不良1例报告》(以下简称“《报告》”)得出结论,光学基因组图谱技术能够成功识别出DMD基因的倒位突变,有望成为该病的补充诊断手段。

但即使综合上述几种基因检测方法,目前仍有约7%的患者找不到致病变异。以往的指南推荐进行肌肉活检以确认抗肌萎缩蛋白的表达情况,但肌肉活检为有创性检查,家长接受度低。

此外,OGM技术也存在一些局限性。其分辨率受限于标记密度,故不能检出较小的突变,也无法检出断裂点或融合位点位于人类参考基因组序列的空白区域的平衡性结构变异。但随着人类基因组序列的完善,OGM对于这些区段的结构变异检测也将逐渐成为可能。

目前,在DMD患者中发现了几千种不同的DMD基因变异,约60%-70%为片段缺失,5%-15%为片段重复,另有20%为点突变、小缺失或插入,而倒位突变较为罕见,不足1%。针对片段缺失或重复检测的“多重连接依赖性探针扩增分析”(multiplexligation-dependentamplification,简称“MLPA”)为DMD的主要检测手段。对于MLPA阴性者,可选择二代测序技术,以发现一些微小变异。

该患儿在MLPA和全外显子测序未发现致病变异后,通过OGM检测,成功识别出1个臂内倒位突变,涉及DMD基因44-55号区段的12个外显子,破坏了该基因的正常结构,属于致病性变异,实现了“分子诊断”。

前述研究显示,DMD基因编码抗肌萎缩蛋白主要分布在骨骼肌和心肌细胞的细胞膜上,起支架作用,能保护肌细胞膜在肌肉收缩时免遭损伤。DMD基因变异导致抗肌萎缩蛋白功能异常,引起肌细胞损伤,进而出现进行性肌肉坏死、萎缩,可导致两种肌病——贝氏肌营养不良和杜氏肌营养不良,后者较重,主要表现为进行性肌无力、发育迟缓和/或发育倒退,最终出现呼吸衰竭及心力衰竭等,体格检查可发现腓肠肌假性肥大、肌力下降等体征。

与传统的染色体结构变异的检测手段相比,OGM具有更高的分辨率,并且能精确提供断裂位点信息与插入方向。此前,相关研究发现OGM能准确识别出8例DMD患者携带的各种结构突变,并能够提供结构突变的断裂位点信息。

该《报告》内容介绍,光学基因组图谱(opticalgenomemapping,简称“OGM”)是一项基于纳米通道的基因作图技术,利用基因组中的特定序列位点直接对大分子DNA进行荧光标记,实现DNA分子的线性光学成像,在识别基因组的结构变异方面具有独特优势。OGM可一次性检出多种不同类型的基因结构突变,包括缺失、易位、倒位、重复、插入、环状染色体、复杂重排和等臂染色体等。

bipo人力资源21月龄男童独自走路不稳,易摔跤,双侧腓肠肌肥大、肌力低下。2岁时通过光学基因组图谱技术识别出系杜氏肌营养不良症(DMD),实现了这名患儿的“分子诊断”。

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